protocol
Es realitzarà la majoria dels procediments següents a la sala de cultius primaris (sala on es treballa amb condicions estèrils i hi trobem les campanes, microscopis, material necessari per experiments i sobretot incubadores amb els diferents tipus de cèl·lules. És obligatori vestir bata, peücs i capell d’un sol ús).
DIA 1
1. Posar 4 cobreobjectes de vidre amb poli-lisina en cada pouet de la placa.
2. Incubar la placa a la campana amb llum ultraviolada durant 10 minuts per eliminar la poli-lisina i quedar-nos només amb la càrrega.
3. Treure de la incubadora (37ºC) una placa de Petri de 10 cm amb un 80% de confluència de cèl·lules U2OS. Per tal que no treballem amb cèl·lules contaminades és millor mirar-les abans al microscopi i si tot és correcte, continuar amb el protocol.
4. Tripsinitzar i resuspendre les cèl·lules amb una pipeta, en la placa de Petri de 10 cm utilitzant medi normal (marca comercial DMEM).
5. Plaquejar cèl·lules (posar-les en la placa de pouets). Posem un volum total de 2 mL per pouet, per tal de tenir, aproximadament, un 40% de confluència cel·lular (ja que en cada pouet tindrem 1,25 mL de medi i 0,75 mL que es refereixen a la quantitat de medi amb cèl·lules extretes de la placa de Petri). Cal ajuntar amb unes pinces els cobres al fons del pouet perquè sinó es quedaran surant. S’esperarà 24 hores fins a portar a terme el tractament amb les drogues perquè interessa tenir una confluència del 80%. Com que el cicle cel·lular dura 24 hores, al dia següent ja estarà tot apunt.
6. Deixar les cèl·lules tota la nit a la incubadora, perquè s’enganxin als cobreobjectes.
DIA 2 (Cap a les 17-18 h)
1. Treure cuidadosament les cèl·lules de la incubadora, posar-les un moment al microscopi i si tot és correcte, continuar.
2. Afegir Nocodazole en 4 dels 6 pouets (pouet del 2 al 5) fins a una concentració final de 100 ng/ml. El pouet 1 es deixarà sense Nocodazole per fer-lo servir com a control.
3. Afegir STLC fins a una concentració final de 50 uM en el pouet 6.
4. Tornar les cèl·lules a la incubadora.
DIA 3 (Cap a les 9-10h)
1. Treure la placa de la incubadora, donar un cop d’ull al microscopi i continuar.
2. Treure el medi dels pouets 3,4 i 5 amb l’ajuda de l’aspirador de la campana. El pouet 2 continua amb Nocodazole per observar com es comporten les cèl·lules.
3. Rentar cuidadosament els pouets del 3-5 amb PBS tres vegades. S’ha de fer lentament perquè sinó les cèl·lules mitòtiques es desenganxarien.
4. Afegir 2 mL de medi fresc en el 3.
5. Afegir 2mL de medi fresc amb Taxol per obtenir una concentració de 1µM.
6. Afegir 2 mL de medi fresc amb MG132 a una concentració de 5 µM
7. Al cap de 30 minuts d’haver rentat els pouets amb Nocodazole, s’han de retirar dos dels quatre cobres que hi ha en cada pouet, del 1 al 6.
8. Fixar els portes amb metanol (-20ºC) i deixar-los dins un recipient amb gel per protegir-les de la calor excessiva.
9. Al cap d’una hora d’haver rentat els pouets que tenien Nocodazole, treure els dos cobres que queden de cada pouet i posar-los també en fred i amb metanol.
Fins aquí el que s’ha fet a sigut preparar les cèl·lules per un immunostainning, per així després poder veure-les al microscopi i diferenciar les seves parts gràcies al seu color.
L’immunostainning és un mètode de tinció basat en les propietats de fluorescència. Mitjançant el procés que s’explicarà a continuació s’aconsegueix que un cos amb fluorescència es col·loqui en aquelles zones que es volen tenyir de la cèl·lula per ser observades al microscopi i en aquest cas, retratades. O sigui, si a la cèl·lula posem un cos fluorescent, aquet emetrà llum de fluorescència que es podrà captar amb el microscopi del laboratori i les regions en què es localitza el cos apareixeran il·luminades.
Els elements a destacar de la cèl·lula en aquest cas són els microtúbuls, el nucli i els centrosomes. Per fer-ho, es marcarà la tubulina amb un anticòs que contingui un fluorocrom que emeti llum vermella, el material genètic amb un que n’emeti de blava i la pericentrina amb un que n’emeti de verda.
Els procés és una mica més complex per a marcar la tubulina i la pericentrina, perquè consisteix en afegir a les cèl·lules anticossos específics per a cada molècula que volem marcar[1], o sigui que s’hi enganxaran, i després afegir els anticossos secundaris[2], que són aquelles molècules que porten incorporat el fluorocrom, el component que la fa fluorescent.
Per a marcar el material genètic amb només un anticòs (DAPI) ja en tenim prou.
Es portarà a terme al laboratori i seguirà el següent procediment:
1. Absorbir amb paper l’excés de metanol dels cobres.
2. Posar els cobres en una placa de Petri, que s’haurà construït abans com a una cambra humida (amb paper de plata perquè no entri la llum i conservar humitat). Rentar amb PBS una vegada els cobres (posant una o dues gotes sobre els cobres amb una pipeta Pasteur i després aspirar-ho).
3. Afegir una gota de PBSBT amb la pipeta Pasteur en cada cobreobjectes i deixar-ho incubant durant una hora.
4. Al cap d’una hora treure el PBSBT amb l’aspirador i incubar durant una hora amb les solucions d’anticossos primaris següents
a. Anticòs primari per a la proteïna alfa tubulina (0.9 µl)
b. Anticòs primari per a la pericentrina (3,6 µl)
Per fer-ho més fàcil es fa una solució mare, en un Falcon barregem 1800 µl de PBSBT amb les quantitats anteriors de solució d’anticòs i afegim 60 µl d’aquesta barreja a cada cobreobjectes.
5. Quan ja ho hem incubat durant una hora, retirem el PBSBT amb l’aspirador, afegim les quantitats següents i ho incubem durant una hora més:
a. Anticòs secundari per a la proteïna alfa tubulina 7µl
b. Anticòs secundari per a la pericentrina 7µl
Preparem una solució en un Falcon amb 1750 µl de PBSBT i les quantitats anteriors d’anticossos. Afegim 60 µl per cobre.
6. Al cap d’una hora que porta incubant-se, ho traiem de la incubadora i ho rentem tres vegades amb PBSBT per poder treure totalment la solució dels anticossos secundaris
7. Incubar durant 5 minuts amb el DAPI (anticòs per al material genètic)
8. Un cop passats els 5 minuts, retirar el DAPI rentant-ho un cop amb PBS
9. Muntar els cobres en porta objectes amb medi de muntatge i deixar-ho assecar a 4 ºC tota la nit.
Es farà tot aquest procés dues vegades, amb una setmana de diferència, per poder tenir dues rèpliques.
[1] En aquest cas s’anomenen anticossos primaris. Un anticòs primari és un anticòs específic contra un antigen (proteïna que volem localitzar) i ha estat creat per un animal.
[2] En afegir l’anticòs primari en un altre animal, diferent al que l’ha creat, aquest fabricarà un altre anticòs, anomenat anticòs secundari, específic contra la cadena pesada de l’anticòs primari.
DIA 1
1. Posar 4 cobreobjectes de vidre amb poli-lisina en cada pouet de la placa.
2. Incubar la placa a la campana amb llum ultraviolada durant 10 minuts per eliminar la poli-lisina i quedar-nos només amb la càrrega.
3. Treure de la incubadora (37ºC) una placa de Petri de 10 cm amb un 80% de confluència de cèl·lules U2OS. Per tal que no treballem amb cèl·lules contaminades és millor mirar-les abans al microscopi i si tot és correcte, continuar amb el protocol.
4. Tripsinitzar i resuspendre les cèl·lules amb una pipeta, en la placa de Petri de 10 cm utilitzant medi normal (marca comercial DMEM).
5. Plaquejar cèl·lules (posar-les en la placa de pouets). Posem un volum total de 2 mL per pouet, per tal de tenir, aproximadament, un 40% de confluència cel·lular (ja que en cada pouet tindrem 1,25 mL de medi i 0,75 mL que es refereixen a la quantitat de medi amb cèl·lules extretes de la placa de Petri). Cal ajuntar amb unes pinces els cobres al fons del pouet perquè sinó es quedaran surant. S’esperarà 24 hores fins a portar a terme el tractament amb les drogues perquè interessa tenir una confluència del 80%. Com que el cicle cel·lular dura 24 hores, al dia següent ja estarà tot apunt.
6. Deixar les cèl·lules tota la nit a la incubadora, perquè s’enganxin als cobreobjectes.
DIA 2 (Cap a les 17-18 h)
1. Treure cuidadosament les cèl·lules de la incubadora, posar-les un moment al microscopi i si tot és correcte, continuar.
2. Afegir Nocodazole en 4 dels 6 pouets (pouet del 2 al 5) fins a una concentració final de 100 ng/ml. El pouet 1 es deixarà sense Nocodazole per fer-lo servir com a control.
3. Afegir STLC fins a una concentració final de 50 uM en el pouet 6.
4. Tornar les cèl·lules a la incubadora.
DIA 3 (Cap a les 9-10h)
1. Treure la placa de la incubadora, donar un cop d’ull al microscopi i continuar.
2. Treure el medi dels pouets 3,4 i 5 amb l’ajuda de l’aspirador de la campana. El pouet 2 continua amb Nocodazole per observar com es comporten les cèl·lules.
3. Rentar cuidadosament els pouets del 3-5 amb PBS tres vegades. S’ha de fer lentament perquè sinó les cèl·lules mitòtiques es desenganxarien.
4. Afegir 2 mL de medi fresc en el 3.
5. Afegir 2mL de medi fresc amb Taxol per obtenir una concentració de 1µM.
6. Afegir 2 mL de medi fresc amb MG132 a una concentració de 5 µM
7. Al cap de 30 minuts d’haver rentat els pouets amb Nocodazole, s’han de retirar dos dels quatre cobres que hi ha en cada pouet, del 1 al 6.
8. Fixar els portes amb metanol (-20ºC) i deixar-los dins un recipient amb gel per protegir-les de la calor excessiva.
9. Al cap d’una hora d’haver rentat els pouets que tenien Nocodazole, treure els dos cobres que queden de cada pouet i posar-los també en fred i amb metanol.
Fins aquí el que s’ha fet a sigut preparar les cèl·lules per un immunostainning, per així després poder veure-les al microscopi i diferenciar les seves parts gràcies al seu color.
L’immunostainning és un mètode de tinció basat en les propietats de fluorescència. Mitjançant el procés que s’explicarà a continuació s’aconsegueix que un cos amb fluorescència es col·loqui en aquelles zones que es volen tenyir de la cèl·lula per ser observades al microscopi i en aquest cas, retratades. O sigui, si a la cèl·lula posem un cos fluorescent, aquet emetrà llum de fluorescència que es podrà captar amb el microscopi del laboratori i les regions en què es localitza el cos apareixeran il·luminades.
Els elements a destacar de la cèl·lula en aquest cas són els microtúbuls, el nucli i els centrosomes. Per fer-ho, es marcarà la tubulina amb un anticòs que contingui un fluorocrom que emeti llum vermella, el material genètic amb un que n’emeti de blava i la pericentrina amb un que n’emeti de verda.
Els procés és una mica més complex per a marcar la tubulina i la pericentrina, perquè consisteix en afegir a les cèl·lules anticossos específics per a cada molècula que volem marcar[1], o sigui que s’hi enganxaran, i després afegir els anticossos secundaris[2], que són aquelles molècules que porten incorporat el fluorocrom, el component que la fa fluorescent.
Per a marcar el material genètic amb només un anticòs (DAPI) ja en tenim prou.
Es portarà a terme al laboratori i seguirà el següent procediment:
1. Absorbir amb paper l’excés de metanol dels cobres.
2. Posar els cobres en una placa de Petri, que s’haurà construït abans com a una cambra humida (amb paper de plata perquè no entri la llum i conservar humitat). Rentar amb PBS una vegada els cobres (posant una o dues gotes sobre els cobres amb una pipeta Pasteur i després aspirar-ho).
3. Afegir una gota de PBSBT amb la pipeta Pasteur en cada cobreobjectes i deixar-ho incubant durant una hora.
4. Al cap d’una hora treure el PBSBT amb l’aspirador i incubar durant una hora amb les solucions d’anticossos primaris següents
a. Anticòs primari per a la proteïna alfa tubulina (0.9 µl)
b. Anticòs primari per a la pericentrina (3,6 µl)
Per fer-ho més fàcil es fa una solució mare, en un Falcon barregem 1800 µl de PBSBT amb les quantitats anteriors de solució d’anticòs i afegim 60 µl d’aquesta barreja a cada cobreobjectes.
5. Quan ja ho hem incubat durant una hora, retirem el PBSBT amb l’aspirador, afegim les quantitats següents i ho incubem durant una hora més:
a. Anticòs secundari per a la proteïna alfa tubulina 7µl
b. Anticòs secundari per a la pericentrina 7µl
Preparem una solució en un Falcon amb 1750 µl de PBSBT i les quantitats anteriors d’anticossos. Afegim 60 µl per cobre.
6. Al cap d’una hora que porta incubant-se, ho traiem de la incubadora i ho rentem tres vegades amb PBSBT per poder treure totalment la solució dels anticossos secundaris
7. Incubar durant 5 minuts amb el DAPI (anticòs per al material genètic)
8. Un cop passats els 5 minuts, retirar el DAPI rentant-ho un cop amb PBS
9. Muntar els cobres en porta objectes amb medi de muntatge i deixar-ho assecar a 4 ºC tota la nit.
Es farà tot aquest procés dues vegades, amb una setmana de diferència, per poder tenir dues rèpliques.
[1] En aquest cas s’anomenen anticossos primaris. Un anticòs primari és un anticòs específic contra un antigen (proteïna que volem localitzar) i ha estat creat per un animal.
[2] En afegir l’anticòs primari en un altre animal, diferent al que l’ha creat, aquest fabricarà un altre anticòs, anomenat anticòs secundari, específic contra la cadena pesada de l’anticòs primari.