resultats
En acabar de realitzar tots els tractaments i l’immunostaining, s’ha de passar a la fase de quantificació. Amb un microscopi de fluorescència (Leica CTR25000) s’han analitzat tots els cobres, totes les cèl·lules. Això vol dir que s’han hagut de quantificar tots els errors mitòtics que posteriorment s’han tabulat.
S’han pres fotografies de totes les cèl·lules tractades amb la càmera Hamamatsu ORCA-ER a un augment de 20x. Es poden dividir les fotografies en tres grups, s’han fet fotografies generals amb el programa Image J per tenir una idea de com queda d’afectat un grup reduit de cèl·lules després del tractament, també s’han fet fotografies per mostrar amb més detall la cèl·lula durant el cicle cel·lular i unes altres per mostrar de ben a prop l’efecte de les substàncies sobre una cèl·lula.
Per interpretar les fotografies cal saber que s’ha fet una mateixa fotografia que es mostra de quatre maneres diferents, ja que amb l’immunostainning es van poder marcar la pericentrina en verd (proteïna dels centrosomes), la tubulina en vermell (microtúbuls) i el nucli en blau. Doncs la forma més correcta de presentar-ho són tres imatges en blanc i negre que representin cada una d’aquestes variables i una en color que correspon a visió general.
S’han pres fotografies de totes les cèl·lules tractades amb la càmera Hamamatsu ORCA-ER a un augment de 20x. Es poden dividir les fotografies en tres grups, s’han fet fotografies generals amb el programa Image J per tenir una idea de com queda d’afectat un grup reduit de cèl·lules després del tractament, també s’han fet fotografies per mostrar amb més detall la cèl·lula durant el cicle cel·lular i unes altres per mostrar de ben a prop l’efecte de les substàncies sobre una cèl·lula.
Per interpretar les fotografies cal saber que s’ha fet una mateixa fotografia que es mostra de quatre maneres diferents, ja que amb l’immunostainning es van poder marcar la pericentrina en verd (proteïna dels centrosomes), la tubulina en vermell (microtúbuls) i el nucli en blau. Doncs la forma més correcta de presentar-ho són tres imatges en blanc i negre que representin cada una d’aquestes variables i una en color que correspon a visió general.
FOTOGRAFIES
Fotografies representatives de cada tractament
Quan es fa una ullada al microscopi es veu una gran quantitat de cèl·lules, algunes en divisió, d’altres en interfase i d’altres amb formes ben estranyes, tot depèn de les condicions a les quals les hagis sotmès. Però quan apropes la projecció es comencen a definir millor els errors mitòtic, els fusos, les cèl·lules en interfase i el seu nucli gran... Per poder veure amb un cop d’ull el que ha passat en un cobreobjectes la millor manera és retallar un trosset d’imatge que sigui representatiu, on es vegi més o menys el percentatge de cèl·lules en divisió i els errors que la majoria de cèl·lules del cobreobjectes presenten.
CONTROL
Quan es fa una ullada al microscopi es veu una gran quantitat de cèl·lules, algunes en divisió, d’altres en interfase i d’altres amb formes ben estranyes, tot depèn de les condicions a les quals les hagis sotmès. Però quan apropes la projecció es comencen a definir millor els errors mitòtic, els fusos, les cèl·lules en interfase i el seu nucli gran... Per poder veure amb un cop d’ull el que ha passat en un cobreobjectes la millor manera és retallar un trosset d’imatge que sigui representatiu, on es vegi més o menys el percentatge de cèl·lules en divisió i els errors que la majoria de cèl·lules del cobreobjectes presenten.
CONTROL
D’esquerra a dreta es veu primer la tubulina, després el nucli, la pericentrina (centrosomes) i per últim la visió en conjunt. S’observa un percentatge baix de cèl·lules en divisió però totes les cèl·lules estant sanes.
NOCODAZOLE TOTA LA NIT (O/N)
NOCODAZOLE TOTA LA NIT (O/N)
El Nocodazole ha fet que no es puguin construir els microtúbuls i per això la cèl·lula agafa aquesta forma tan estranya, com si no tingués consistència. Com que no hi ha microtúbuls, cap cèl·lula ha pogut construir el fus mitòtic, per tant cap cèl·lula ha passat de la profase o prometafase..
NOCODAZOLE TOTA LA NIT, RENTAR MEDI PER TREURE EL NOCODAZOLE I DEIXAR 30 MINUTS EN MEDI NORMAL
NOCODAZOLE TOTA LA NIT, RENTAR MEDI PER TREURE EL NOCODAZOLE I DEIXAR 30 MINUTS EN MEDI NORMAL
En deixar les cèl·lules sense Nocodazole durant 30 minuts s’han pogut refer els microtúbuls. Es recupera la consistència de les cèl·lules i les que han d’entrar en divisió ho fan sincronitzadament. Algunes cèl·lules arriben a metafase.
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI PER TREURE'L I DEIXAR 60 MINUTS EN MEDI NORMAL
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI PER TREURE'L I DEIXAR 60 MINUTS EN MEDI NORMAL
Tal com s’observa en els mosaics anteriors el citoesquelet de la cèl·lula ja li dóna forma. Com que s’han deixat les cèl·lules fins a 60 minuts en un medi normal les cèl·lules en divisió han pogut arribar fins a la metafase i alguna fins l’anafase.
NOCODAZOLE O/N RENTAR MEDI I POSAR TAXOL 1 µM DURANT 30 MINUT
NOCODAZOLE O/N RENTAR MEDI I POSAR TAXOL 1 µM DURANT 30 MINUT
Les cèl·lules no han pogut passar de la prometafase. S’han format petites aglomeracions de microtúbuls astrals, que són els que primer creixen del fus i s’encarreguen d’ancorar els pols del fus a la membrana cel·lular.
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI I POSAR TAXOL 1 µM DURANT 60 MINUTS
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI I POSAR TAXOL 1 µM DURANT 60 MINUTS
El resultat és ben bé el mateix que posant Taxol durant 30 minuts. Es poden veure també aglomeracions de microtúbuls astral que no han anat a més, en el sentit que no s’ha pogut construir el fus mitòtic.
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI I POSAR EN MG132 DURANT 30 MINUTS
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI I POSAR EN MG132 DURANT 30 MINUTS
Hi ha cèl·lules en divisió però cap d’elles ha pogut passar a l’anafase. Les poques que han arribat a la metafase s’hi han estancat.
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI I POSAR EN MG132 DURANT 60 MINUTS
NOCODAZOLE O/N, RENTAR MEDI I POSAR EN MG132 DURANT 60 MINUTS
Tot i que les cèl·lules han tingut més temps per poder avançar en les etapes de la divisió no han pogut passar de la metafase a l’anafase.
STLC O/N
STLC O/N
Una gran quantitat de cèl·lules del cobreobjectes estan en divisió però cap ha pogut formar un fus de dos pols, sinó que totes presenten un fus monopolar on s’hi ha disposat el material genètic però no s’ha avançat cap a l’anafase perquè no es podia separar el fus amb aquesta forma.
NOCODAZOLE O/N RENTAR I DEIXAR EN MEDI NORMAL DURANT 30 MINUTS, AFEGIR TAXOL A 1 µM I DEIXAR ACTUAR DURANT 30 MINUTS, DESPRÉS RETIRAR EL MEDI AMB EL TAXOL I DEIXAR-HO EN MEDI NORMAL
NOCODAZOLE O/N RENTAR I DEIXAR EN MEDI NORMAL DURANT 30 MINUTS, AFEGIR TAXOL A 1 µM I DEIXAR ACTUAR DURANT 30 MINUTS, DESPRÉS RETIRAR EL MEDI AMB EL TAXOL I DEIXAR-HO EN MEDI NORMAL
Aquest és un experiment que es va realitzar al final de l’estada al laboratori ja que al principi no estava contemplada la seva realització ni en el protocol ni en la hipòtesi general. Es va decidir realitzar després d’observar que en els cobres on s’havien tractat les cèl·lules amb Taxol només hi havia petites aglomeracions de microtúbuls astrals ja que no havien tingut prou temps per intentar construir un fus mitòtic de dos pols. Es va decidir portar a terme amb la hipòtesi que les cèl·lules tindrien temps per construir un fus mitòtic però que tindria una forma diferent a la de les cèl·lules amb una metafase normal. Aquesta forma diferent és deguda a que s’estabilitzen els microtúbuls astrals i fan eixamplar el fus.
Fotografies del cicle cel·lular al detall
Encara que no entrés dins de l’objectiu del treball retratar com té lloc el cicle cel·lular s’han seleccionat unes poques imatges amb l’objectiu de poder apreciar el paper dels microtúbuls en cada fase.
INTERFASE
Fotografies del cicle cel·lular al detall
Encara que no entrés dins de l’objectiu del treball retratar com té lloc el cicle cel·lular s’han seleccionat unes poques imatges amb l’objectiu de poder apreciar el paper dels microtúbuls en cada fase.
INTERFASE
Es veuen els microtúbuls, en vermell, com li donen forma a la cèl·lula i es disposen al voltant del nucli. Els centrosomes, que són els dos puntets de la tercera fotografia, no es troben junts però tampoc un a cada pol.
PROFASE
PROFASE
En la primera fotografia
es veu com els microtúbuls ja han agafat una forma diferent i hi ha dos punts
més marcats, un a cada pol, que no pertoquen als centrosomes, sinó que són els
microtúbuls astrals. En la segona fotografia el nucli es veu mes llampant
perquè s’ha començat a condensar i a la tercera els centrosomes ja s’han
separat.
PROMETAFASE
PROMETAFASE
Els microtúbuls comencen a
construir el fus mitòtic.
METAFASE
METAFASE
El fus ja està del tot
construït i els cromosomes ja s’han col·locat. Una metafase perfecta, sense cap
error.
ANAFASE
ANAFASE
El fus mitòtic s’escurça i els cromosomes se’n van cap a una banda o l’altra.
TELOFASE
TELOFASE
El fus es fa molt més estret i els cromosomes encara queden més separats.
CITOCINESIS
CITOCINESIS
Les cèl·lules en citocinesis són les de l’esquerra de la imatge i es pot veure com s’estan a punt de separar físicament, estan unides per només un trosset de microtúbuls.
Fotografies dels errors mitòtics
Per tal de veure al detall com han actuat les substàncies amb les quals s’han tractat les cèl·lules s’ha fet una fotografia de cada error mitòtic que després s’ha considerat a les taules de quantificació i els gràfics.
Hi ha errors que amb total certesa es pot afirmar quina n’ha estat la causa. Per exemple, en el cas dels fusos monopolars tenen lloc perquè l’afegiment de STLC durant tota la nit inhibeix la funció de la proteïna Eg5 de separar els centrosomes. Però l’aparició de metafases en que els cromosomes no és disposen correctament en el fus és una qüestió d’atzar, o bé es deu a un factor que no s’ha considerat en aquest treball. Tot i que cal tenir en compte que es sotmeten les cèl·lules a un desequilibri molt gran (substàncies tòxiques, en alguns casos s’inhibeix el proteasoma...)
CROMOSOMES MAL DISPOSATS (LAGGING CHROMOSOMES)
Fotografies dels errors mitòtics
Per tal de veure al detall com han actuat les substàncies amb les quals s’han tractat les cèl·lules s’ha fet una fotografia de cada error mitòtic que després s’ha considerat a les taules de quantificació i els gràfics.
Hi ha errors que amb total certesa es pot afirmar quina n’ha estat la causa. Per exemple, en el cas dels fusos monopolars tenen lloc perquè l’afegiment de STLC durant tota la nit inhibeix la funció de la proteïna Eg5 de separar els centrosomes. Però l’aparició de metafases en que els cromosomes no és disposen correctament en el fus és una qüestió d’atzar, o bé es deu a un factor que no s’ha considerat en aquest treball. Tot i que cal tenir en compte que es sotmeten les cèl·lules a un desequilibri molt gran (substàncies tòxiques, en alguns casos s’inhibeix el proteasoma...)
CROMOSOMES MAL DISPOSATS (LAGGING CHROMOSOMES)
En la segona fotografia es
veu clarament com tot el material genètic no es troba disposat “en fila”, en el
pla metafàsic sobre el fus. Aquestes dues ratlletes que s’aprecien corresponen
a dos cromosomes que no estan ben col·locats.
Quan una cèl·lula en mitosi presenta aquest error no es produeix un arrest mitòtic, la divisió continuarà el seu curs normal, però en separar-se les dues cèl·lules filles no tindran la mateixa quantitat de material genètic, per tant no tindran la mateixa informació.
FUSOS MULTIPOLARS (MULTIPOLAR SPINDLES)
Quan una cèl·lula en mitosi presenta aquest error no es produeix un arrest mitòtic, la divisió continuarà el seu curs normal, però en separar-se les dues cèl·lules filles no tindran la mateixa quantitat de material genètic, per tant no tindran la mateixa informació.
FUSOS MULTIPOLARS (MULTIPOLAR SPINDLES)
S’atribueix un error de fus multipolar a totes les cèl·lules que no presenten un fus de dos pols. Pot estar causat per diversos factors, per exemple que la replicació de centrosomes vagi malament, que és el que passa en el cas de la fotografia. Es veu un fus tripolar, això és degut a que hi ha tres centrosomes. També pot ser que la replicació de centrosomes vagi bé però que es trenqui un tros d’un centrosoma i el número final d’aquests sigui tres i no dos com passaria en una cèl·lula normal.
Amb aquest error, el més probable, és que la cèl·lula continuï la divisió. O sigui, els cromosomes es disposaran sobre el fus de manera irregular i el resultat seran dues cèl·lules amb una forma i una informació genètica molt estranyes que acabarà optant per l’apoptosi.
FUS MONOPOLAR (MONOPOLAR SPINDLE)
Amb aquest error, el més probable, és que la cèl·lula continuï la divisió. O sigui, els cromosomes es disposaran sobre el fus de manera irregular i el resultat seran dues cèl·lules amb una forma i una informació genètica molt estranyes que acabarà optant per l’apoptosi.
FUS MONOPOLAR (MONOPOLAR SPINDLE)
Com que els centrosomes no s’han separat al seu voltant han crescut microtúbuls que no han pogut formar un fus bipolar. El material genètic només s’ha pogut disposar com normalment ho faria i la divisió no podrà tenir lloc.
AGLOMERACIONS DE MICROTÚBULS ASTRALS (SMALL ASTERS)
AGLOMERACIONS DE MICROTÚBULS ASTRALS (SMALL ASTERS)
En aquest cas es veuen afectats els microtúbuls astrals que no han pogut créixer i formar el fus mitòtic i formen aquestes aglomeracions al voltant dels centrosomes i les molècules de GDP de la cèl·lula.
FUS MITÒTIC AMB ELS MICROTÚBULS ASTRALS ESTABILITZATS (ABNORMALS SPINDLE SHAPE)
FUS MITÒTIC AMB ELS MICROTÚBULS ASTRALS ESTABILITZATS (ABNORMALS SPINDLE SHAPE)
Aquí els microtúbuls
astrals també estan afectats però han tingut temps de créixer i s’ha pogut
formar el fus mitòtic. Però un fus més ample que els d’una cèl·lula normal,
sense tractament, i que aportarà més errors a l’hora de dividir el material
genètic.